目前应用较广的组织工程半月板中的种子细胞包

  已有研究表明,内源性干/祖细胞在软骨、骨、心肌的修复中极具发展前景。Seol和Yu等发现软骨祖细胞(CPCs)能够迁移到受损软骨处,参与软骨早期修复,显著提高软骨自我修复能力。Mauck等首先发现,从牛半月板的滑膜缘、游离缘和前后角分离的部分半月板纤维软骨细胞中,有一部分具有多向分化潜能,能被进一步诱导分化为成熟软骨细胞、脂肪细胞和骨细胞,以半月板滑膜缘的这种细胞可塑性最好。

  在半月板修复重建中,还没有将组织工程半月板用在临床患者的先例,但今后,优秀的组织工程半月板方案用在半月板部分切除、次全切除和全切除的修复重建中的可能性,会随着人们对组织工程半月板研究的深入,逐渐得以实现。

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  MeSCs具有集落形成、自我增殖、多向分化潜能等干细胞特质,已有实验证明在部分动物关节腔内注射人源MeSCs能够有效修复受损的半月板,抑制OA进展。但因为不同动物半月板的结构特点和免疫原性的差异,该实验结果目前还不能推广到人体。

  虽然以上实验证明了向兔、鼠膝关节内注射人MeSCs可促进半月板再生,但兔、鼠的半月板与人的差别较大,其半月板损伤后可自动愈合的潜力也更大,而人的半月板的特定部位和区域的损伤则很难自愈,所以MeSCs能否在半月板不能自愈的动物体内或患者的临床治疗中发挥上述作用还尚不清楚。

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  我们在座每一位女企业家都有这种精神。在本文综述的相关文献中,这种细胞一般被称为半月板干细胞(MeSCs)或半月板祖细胞(MPCs),如无特殊说明,本文将其统称为MeSCs。另外,当半月板发生损伤后,MeSCs可通过SDF-1/CXCR4的趋化作用迁移至损伤部位,发挥半月板组织的修复功能,与关节软骨修复中的趋化机制有所不同。同种异体MeSCs在半月板损伤或切除后修复重建中的应用,首先要解决免疫排斥问题。(6)区域分布的异质性:虽然在半月板各部分都能够分离出MeSCs,但Seol发现,在牛、羊的半月板中,MeSCs在红区的数量远大于白区;但与骨髓、滑膜等来源的MSCs不同的是:(1)MeSCs的细胞群落更小;(3)表达CD34的比例更少;既然半月板含有具有损伤修复功能的MeSCs,为何半月板白区损伤后,通常不能自愈?对于这个问题主要有以下几种解释:首先,半月板游离缘为了适应承重等生理功能,组织中的血管在发育过程中不断退化,组织密度显著提高,这种高密度阻止了MeSCs迁移到损伤部位;(7)趋化因子的差异性:当半月板白区损伤时,会有大量MeSCs通过趋化作用集中于损伤部位,发挥组织修复功能。(5)Gamer发现鼠的MeSCs还表达了与胚胎半月板相关的标志物Lox、lgf-1;(4)更倾向于分化为软骨细胞,并高度表达II型胶原及双链蛋白聚糖;在今后的研究中如果构建趋化因子的梯度或改善局部生物力学条件,可能会增加MeSCs在局部的聚集和修复作用。已有研究表明BMSCs、牙周膜干细胞、脂肪干细胞、脐带血干细胞都拥有免疫抑制表型,能够有效抑制移植后免疫排斥反应。)勤奋是专注做事,任务来了一做到底,像锥子一样,像钉子一样把它做实。其次,即使有部分MeSCs存在于损伤处,因为该部位承受的负荷不断变化,新生的半月板组织在发育成熟之前不断被破坏,最终发生机化;本网注明来源为其他媒体的内容为转载,转载仅作观点分享,版权归原作者所有,如有侵犯版权,请及时联系我们。Segawa等在人的半月板碎片中发现了一种间充质干细胞亚群,其表型与MSCs十分类似,而Huang等发现这种细胞与半月板纤维软骨细胞相比,偏向于卵圆形,其胞体更小,细胞核更大,具有更强的增殖和集落形成能力。而对于膝关节内注入MeSCs,浣嗘洿浠や汉鎰忓鐨勬槸杩炶€佸笀涔熸嬁浠栧畬鍏ㄦ病鏈夊姙娉?,因为自体内源性MeSCs数量十分有限,体外培养扩增的MeSCs培养周期很长,很难付诸临床实践,于是研究者把目光聚焦于同种异体和异种异体MeSCs。(本网站所有内容,凡注明来源为“医脉通”,版权均归医脉通所有,未经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,否则将追究法律责任,授权转载时须注明“来源:医脉通”。

  Buschmann等比较了人和兔、羊的半月板的区别,发现细胞分布、血管、胶原结构等主要的结构特点,人和羊相似程度较大,而Murphy等证明了羊半月板损伤后没有自愈能力,所以后续还需在羊、狗、猪等大型哺乳动物体内进行相关实验,验证MeSCs修复半月板的功能。

  在已有研究中,提取MeSCs的主要材料是人的半月板碎片及动物(牛、兔、羊)的半月板。具体操作步骤如下:首先去除半月板表面黏附的其他组织,用含双抗的PBS漂洗后将半月板组织剪成1mm×1mm×1mm的小块,37℃条件下在含有I、II型胶原酶的PBS溶液中消化4~6h,之后离心弃去上清液,显微镜下计数后重悬于加入细胞悬液等体积的含10%FBS的低糖DMEM新鲜培养基终止消化,用200目筛网过滤细胞悬液,骞惰〃杈句簡瀵归暱鏈熷墠鏅殑淇″績1200r/min离心5min,弃去上清,PBS洗涤3次,显微镜下细胞计数后按1×106/瓶(625px2培养基)重悬于完全培养基(低糖DMEM,10%FBS,3.7g/LNaHCO3,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,25ng/ml两性霉素B,2mmol/LL-谷氨酰胺),置于37℃含5%CO2和95%湿度的培养箱中孵育,48~72h后,用PBS洗掉未贴壁的细胞,更换新的完全培养基。当贴壁生长的细胞达杯底80%~90%时,用0.25%胰蛋白酶消化,并按1:2或1:3的比例传代,当细胞形态较为均一、细长之后,即成功提取MeSCs。虽然该方法类似于软骨细胞的分离培养,而不是MeSCs的分离纯化方法,但目前没有更详细的方法记录,而且使用该方法分离培养的MeSCs经过Fu等的鉴定,其纯度达到90%以上。

  MeSCs除了具有修复重建损伤或缺失半月板的作用,还有治疗OA的作用。体外实验证实,MeSCs通过抑制缺氧诱导因子2α(HIF-2α)降低了损伤部位基质金属蛋白酶、蛋白聚糖酶的水平,进而有效治疗OA,保护关节面。同其他干细胞一样,MeSCs也具有对局部炎症反应的直接抑制作用,从而有效预防OA的发生。

  目前研究者对于MeSCs的应用主要有以下途径:(1)通过细胞因子调节MeSCs增殖分化,促进其发挥组织修复功能;(2)向膝关节内注入MeSCs,以修复损伤半月板。Muhammad等发现,与CPCs类似,MeSCs的分化受RUNX2和SOX9平衡的影响。在体外,TGF-β作用于人源MeSCs,使其SOX9表达增多,RUNX2受到抑制,进而有效促进软骨组织再生,抑制OA发展。但是,MeSCs在体内的增殖分化有更精细的调节机制存在,单纯注射TGF-β治疗效果非常有限,而且会产生诸如滑膜增生、炎症反应、骨形成等副作用。

  目前应用较广的组织工程半月板中的种子细胞包括半月板纤维软骨细胞和间充质干细胞。自体半月板纤维软骨细胞的来源和数量有限,增殖及产生细胞外基质能力均具有一定局限性,导致其应用受限。作为种子细胞,虽然间充质干细胞增殖分化能力强,但来自骨髓、滑膜、脂肪组织的间充质干细胞获取时需进行有创操作,扩增过程中还有容易导致软骨过度增生和骨化的问题,因此,近年来,半月板干细胞(MeSCs)成为半月板修复领域的研究热点之一,本文就其研究进展进行综述。

  有实验表明,异种异体MeSCs也可能被用来修复重建损伤或缺失的半月板组织。Shen通过进一步实验发现25,,向半月板损伤的兔、鼠的膝关节中注射人源MeSCs,增强了损伤组织的再生能力,产生了大量符合生理特点的细胞外基质以及半月板纤维软骨细胞,抑制了OA的进程。

  半月板是位于股骨与胫骨之间的半月形纤维软骨组织,主要由半月板细胞及相关细胞外基质构成。半月板滑膜缘区富含血管,称为红区,具有较好的自我修复能力,该区损伤可采用保守治疗或手术缝合的方式治疗;半月板游离缘的血供少,被称为白区,两者之间有个被称为红白区的过渡区;而一旦撕裂涉及到游离缘区,常常需要部分切除损伤的半月板。当整个半月板绝大部分都被严重撕裂累及,病程很长,又无法通过缝合修复,往往需要进行半月板次全切除或全切除手术,无论是半月板部分切除还是半月板次全切除或完全切除术,后期都可能会导致股四头肌萎缩、骨性关节炎(OA),甚至膝关节畸形和膝关节运动障碍。

  基于这种结果,Shen等从兔半月板中分离出了MeSCs,通过体外实验发现其MCHII阴性,在抗原呈递细胞存在的情况下,MeSCs也不会引发免疫反应,而向兔膝关节注射同种异体MeSCs的体内实验也证实了其不会引起免疫排斥反应。这种趋化作用可能是通过基质细胞衍生因子(SDF-1)介导的。Shen等在体内及体外实验均发现SDF-1在半月板损伤部位表达明显上调,其作用于MeSCs表面的CX⁃CR4,发挥趋化作用,当加入AMD3100(CXCR4的选择性拮抗因子)后,这种趋化作用消失。Mauck和Segawa等的发现表明,MeSCs是客观存在的。最后,如前文所述,MeSCs的迁移需要SDF-1等趋化因子参与,但机体内由于组织破坏与炎症反应很难形成一个合适的趋化因子梯度,使得MeSCs不能有效迁移。介导半月板修复中MeSCs迁移的趋化因子可能与介导关节软骨修复的趋化因子不同,因为在关节软骨修复中,介导CPCs趋化修复损伤的关节软骨的趋化因子是高迁移率族蛋白1(HMGB1)及细胞裂解产物等细胞警报素(alarm⁃ins),而MeSCs对这些因子不敏感综上所述,MeSCs具有集落生成、自我增殖及多向分化潜能等“干性”特点,并表达多种间充质干细胞标志物,但与其他组织来源的MSCs相比,MeSCs具有更容易分化为半月板纤维软骨细胞的倾向。这个结果使得膝关节内注射同种异体MeSCs治疗半月板损伤成为可能。(2)增长更慢。

  作为半月板来源的间充质干细胞,MeSCs与骨髓、脂肪来源的间充质干细胞有许多共同点,但又有独特之处。Ding、Gamer、Seol、Shen以及Fu等分别在兔、鼠、牛等动物的半月板以及人损伤的半月板碎片中分离出了MeSCs。这些细胞形态较为统一,在培养皿表面贴附生长,并具有集落生成、自我增殖、多向分化潜能(可分化为软骨、骨、脂肪等细胞)等干细胞特性。与骨髓间充质干细胞(BMSCs)类似,MeSCs表达CD44、CD90、CD73、CD105、SSEA-4、Nanog、核干细胞因子(nucleostemin)、strol-1、Sca-1等间充质干细胞标志物,而很少表达CD34、CD45等造血干细胞标志物。

  现在对MeSCs的认识程度还不够深入,接下来对MeSCs的研究应该重点放在:(1)进一步解决MeSCs的分离、纯化和扩增的问题,目前鲜有这方面的研究报告;(2)MeSCs在哺乳动物体内增殖、分化、迁移及其与半月板损伤修复的调控机制之间的关系还不清楚,直接影响着临床应用方案的设计和实施,例如在半月板损伤的动物膝关节内构建趋化因子梯度的可行性等;(3)同种异体、异种异体的MeSCs治疗半月板损伤的免疫排斥问题还有待进一步验证;(4)逐步在羊、狗、猪等大型哺乳动物膝关节半月板撕裂、全切除和部分切除的动物模型的撕裂愈合、组织工程产品的移植重建和缺损修复中应用MeSCs作为关节内注射细胞或种子细胞。

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